Die Trypanblau-Ausschlussmethode, die derzeit von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittelagentur (EMA) unterstützt wird, ist der Standard für die Bewertung der Gesamtzellzahl und der Viabilität von Zellen bei Zelltherapien. Mit dem Fortschreiten der Zelltherapie und der Verwendung immer komplizierterer Zellproben, wie Immunzellen, Primärzellen und Stammzellen, werden jedoch die Grenzen der Trypanblau-Methode immer deutlicher, die durch eine Überschätzung der Zelllebensfähigkeit, Kontamination mit roten Blutkörperchen und Subjektivität bei der Interpretation gekennzeichnet sind.
Als Antwort auf diese Herausforderungen wurden fluoreszenzbasierte Zellzählmethoden eingeführt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die selektiv auf Zellkerne abzielen, sind diese Techniken unempfindlich gegen den Einfluss von Rückständen oder roten Blutkörperchen (RBC) und gewährleisten so eine präzisere Zellzählung und Viabilitätsbewertung. Bislang beschränken sich die zugelassenen Methoden zur fluoreszenzbasierten Zellzählung auf den Einsatz von Durchflusszytometern. [1]∙[2]. Aus industrieller Sicht besteht jedoch die dringende Notwendigkeit, den Einsatz von automatisierten Zellzählgeräten auf Fluoreszenzbasis auszuweiten, um sowohl die Forschungs- und Entwicklungsgeschwindigkeit als auch die Produktionseffizienz zu erhöhen.
In Anerkennung dieser Einschränkungen hat das koreanische Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit (MFDS) seine Richtlinien für Zelltherapieprodukte aktualisiert und empfiehlt nun die Verwendung automatisierter Zellzähler mit Fluoreszenzkernfärbung. NanoEntek steht an der Spitze dieses Fortschritts und bietet ein umfassendes Sortiment an fortschrittlichen automatisierten Fluoreszenzzählern an.
Die Produktpalette von NanoEntek umfasst den Einkanal-Fluoreszenz-Zellzähler ADAM™ MC2/CellT und den Dual-Fluoreszenz-Zellzähler ADAM™ MC Plus/CellT Plus. Darüber hinaus bietet NanoEntek den hochentwickelten Dreikanal-Fluoreszenz-Zellanalysator ADAMII™ LS/CDx an. Für Anwendungen, die einen hohen Durchsatz und Präzision erfordern, zeichnet sich der automatisierte Hochdurchsatz-Dual-Fluoreszenz-Zellzähler EVE™ HT FL von NanoEntek aus, der sich sowohl für die Zelltherapieforschung als auch für die Herstellung hervorragend eignet (siehe Abbildung „LS-Produktpalette von NanoEntek“ unten). Diese Verlagerung hin zu fluoreszierenden Kernfärbemethoden, unterstützt durch diese fortschrittlichen automatisierten Zellzähler, bietet eine zuverlässigere und effizientere Option zur Bewertung der Viabilität von Zellen in Zelltherapieprozessen.
1. Aktuelle Richtlinien der US FDA und EMA
Derzeit erkennen die US-amerikanische FDA und die EMA die Trypanblau-Ausschlussmethode, sowohl in manueller als auch in automatisierter Form, als Standardmethode für die Qualitätskontrolle bei Zelltherapien an. Diese Methode hat jedoch inhärente Grenzen, die sie für die Komplexität moderner Zelltherapien weniger geeignet machen. Zum Beispiel neigt die TB-basierte Viabilität dazu, die Viabilität im Vergleich zu fluoreszenzbasierten Methoden zu überschätzen [3]∙[4]. Das Vorhandensein von Erythrozyten in den Proben macht die Gesamtzellzahl unzuverlässig, und die TB-basierte manuelle Zählung ist von Natur aus subjektiv und variabler [5]. Um dieses Problem zu lösen, haben die Aufsichtsbehörden teilweise fluoreszenzbasierte Methoden der Zellzählung zugelassen. Allerdings ist diese Zulassung derzeit auf Durchflusszytometer beschränkt.
Aus industrieller Sicht besteht ein wachsender Bedarf an einer Ausweitung des Einsatzes fluoreszenzbasierter automatisierter Zellzählgeräte. Dies würde nicht nur die Forschungs- und Entwicklungsprozesse beschleunigen, sondern auch die Produktionseffizienz erhöhen. Eine Ausweitung der Zulassung auf automatisierte Fluoreszenz-Zellzähler könnte die Qualität und Effizienz der Zelltherapie-Herstellung erheblich verbessern.
2. Beschränkung der traditionellen Zellmessmethode: Trypanblau-Ausschlussverfahren
(1) Definition der Trypanblau-Ausschlussmethode:
Der Trypanblau-Ausschlusstest ist eine der ältesten und am häufigsten verwendeten Methoden zur Bestimmung der Viabilität von Zellen. Das Prinzip des Färbungsmechanismus von Trypanblau (Azofarbstoff) beruht auf der unterschiedlichen Durchlässigkeit von Zellmembranen.
Lebensfähige Zellen verfügen über eine intakte und funktionsfähige Zellmembran, die bestimmte Moleküle selektiv durchlässt. Trypanblau-Partikel können aufgrund ihrer Größe und Ladung die geschädigten oder beschädigten Membranen nicht lebensfähiger Zellen durchdringen und in den intrazellulären Raum gelangen.
Normalerweise wird das intrazelluläre Milieu, insbesondere das Zytoplasma, bei gesunden Zellen durch aktive Prozesse wie ATP-abhängige Ionenpumpen und Transporter aufrechterhalten. Diese Zellen nutzen ATP-Energie, um die Trypanblau-Partikel durch einen als Exozytose bezeichneten Prozess aktiv auszustoßen, wodurch der Farbstoff effektiv aus dem intrazellulären Raum entfernt und die Anfärbung der Zellen verhindert wird.
Umgekehrt sind nicht lebensfähige oder tote Zellen nicht in der Lage, ATP (Adenosintriphosphat) zu erzeugen, und können folglich keine Exozytose durchführen. Infolgedessen halten sie den Farbstoff Trypanblau in ihrem Zytoplasma zurück, wodurch sie unter dem Mikroskop blau oder gefärbt erscheinen.
Mit dieser Färbemethode können Forscher lebende Zellen (ungefärbt) und tote Zellen (blau) innerhalb einer bestimmten Population direkt identifizieren und zählen.
(2) Beschränkungen der Trypanblau-Ausschlussmethode:
In der Vergangenheit wurden in der zellbasierten Forschung hauptsächlich immortalisierte Zelllinien wie CHO-Zellen verwendet. Mit den Fortschritten auf dem Gebiet der Zelltherapie werden jedoch immer komplexere Probentypen verwendet, darunter Primärzellen, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC), Stammzellen, dissoziierte Tumorzellen und sogar gentechnisch veränderte T-Zellen. Diese Zellen variieren in Größe, Form und Aggregationseigenschaften, so dass die herkömmliche Trypanblau-Ausschlussmethode für genaue Ergebnisse weniger zuverlässig ist, insbesondere bei heterogenen Proben wie PBMC, Stammzellen und Primärzellen.
Im Folgenden werden einige Einschränkungen der Trypanblau-Ausschlussmethode erläutert:
Erstens ist Trypanblau für Säugetierzellen giftig. Selbst lebensfähige Zellen werden schließlich mit Trypanblau angefärbt, da der toxische Farbstoff ihre Zellmembran durchdringt, was etwa 5 bis 30 Minuten nach der Exposition zum Zelltod führt. Daher müssen genaue Messungen innerhalb von 3 bis 5 Minuten nach Einbringen des Farbstoffs vorgenommen werden. Darüber hinaus ist Trypanblau nicht nur für Zellen, sondern auch für den Menschen schädlich, da es als Karzinogen eingestuft wird, das nach längerer Exposition Krebs verursachen kann.
Außerdem kann Trypanblau die Morphologie toter Zellen zu einer diffusen Form verändern, was zu einer Überschätzung der Viabilität führen kann. Bei der Anfärbung mit Trypanblau beginnen die Zellen sofort zu zerreißen und werden zu diffusen Objekten. Einige tote Zellen können nach der Trypanblau-Färbung verschwinden, was zu einer Unterzählung der Gesamtzellen und damit zu einer Überschätzung der Viabilität der Zellen führt. [4] Mit anderen Worten: Die Toxizität von Trypanblau kann die Messgenauigkeit beeinträchtigen, indem sie die Viabilität im Laufe der Zeit verändert, was zu einer Unterschätzung der Viabilität der Zellpopulation führt. [4]Diese Ungenauigkeiten könnten sich auf die Ergebnisse von Zelltherapien auswirken, die auf genaue Messungen der Immunzellen angewiesen sind, die den Patienten zurückinfundiert werden, und unterstreichen den Bedarf an verbesserten Lösungen wie der Fluoreszenz-Zellkernfärbemethode.
3. Notwendigkeit von Fluoreszenz-Zellkernfärbemethoden im Prozess der Herstellung von Zelltherapien
Bei der Herstellung von Zelltherapieprodukten werden verschiedene Immunzellen aus menschlichem Blut extrahiert. Diese Zellen sind jedoch häufig mit Erythrozyten verunreinigt, die bei der herkömmlichen Trypanblau-Ausschlussmethode fälschlicherweise als tote Zellen identifiziert werden können. Diese Kontamination erstreckt sich auch auf zelluläre Rückstände und nicht zelluläre Partikel, was zu verzerrten Daten führt. Darüber hinaus sind rote Blutkörperchen, die mit PBMC vermischt sind, bei der Zählung von Immunzellen nicht unterscheidbar, was zu ungenauen Gesamtzellzahlwerten führt. Diese Ungenauigkeiten können die Forschung, Entwicklung und Produktion verschiedener Immunzelltherapien wie CAR-T- und NK-Zelltherapien erheblich beeinträchtigen, was sich letztlich auf die Gesamtqualität der endgültigen zellbasierten Therapien auswirkt.
Darüber hinaus werfen primäre Zellen, die aus Blut, Gewebe oder Organen extrahiert werden, ähnliche Probleme auf, da sie im Vergleich zu immortalisierten Zelllinien relativ viele Rückstände enthalten. Dies kann dazu führen, dass Rückstände falsch als Zellen gezählt werden, was die Ungenauigkeit der Gesamtzellzahl noch vergrößert und die Qualität von Forschung, Entwicklung, Produktion und Herstellung zellbasierter Therapien beeinträchtigt.
Darüber hinaus gelten die Einschränkungen der auf Trypanblau basierenden Zellzählungsmethode auch für ihre Auswirkungen auf die Überlebensraten der Zellen. Die Inkonsistenz und Ungenauigkeit der Gesamtzellzahlwerte hat direkten Einfluss auf die Bewertung der Zelllebensfähigkeit. Beispielsweise weisen Zellen, die reichlich in Immunzellen wie PBMC vorkommen, aufgrund ihrer geringeren Größe (8 μm) im Vergleich zu herkömmlichen Zelllinien (>10 μm) bei der Untersuchung unter dem Hellfeldmikroskop eine höhere Variabilität des Variationskoeffizienten der Zellviabilität (CV %) auf.
Im Gegensatz zu konventionellen Zelllinien, bei denen die Trypanblau-Färbung die Unterscheidung zwischen lebenden Zellen (helles Inneres) und toten Zellen (dunkelblau) ermöglicht, stellt die Bestimmung der Viabilität kleinerer Zellen wie PBMC anhand der inneren Helligkeit eine große Herausforderung dar. Diese Herausforderung führt zu erheblichen Diskrepanzen zwischen den Anwendern und zu einer schlechten Fähigkeit, die Viabilität mit herkömmlichen Zellzählmikroskopen zu unterscheiden.
Um diese Probleme zu entschärfen, setzen Anbieter jetzt automatisierte Zellzähler mit Fluoreszenz-Zellkernfärbetechniken ein. Bei diesem Ansatz werden die Zellkerne fluoreszierend gefärbt, um unabhängig von der Zellgröße einheitliche und genaue Werte zu erhalten. Die Zählung der toten Zellen basiert auf dem Vorhandensein von gefärbten Zellkernen unter Verwendung von Reagenzien wie PI oder DAPI, wodurch die Genauigkeit gewährleistet und externe Störungen minimiert werden.
Diese Methode eignet sich sowohl für immortalisierte Zelllinien als auch für primäre Zellen, die aus Blut, Gewebe oder Organen entnommen wurden, und liefert trotz der Kontamination mit Rückständen oder Erythrozyten konsistente und genaue Ergebnisse. Die Verwendung automatisierter Methoden der Zellzählung, die auf der Zellkern-Fluoreszenzfärbung basieren, gewährleistet sowohl bei der Bestimmung der Gesamtzellzahl als auch bei der Messung der Viabilität eine hohe Genauigkeit und minimale externe Störungen, was eine zuverlässige Datenerfassung ermöglicht und die Forschung, Entwicklung und das Prozessmanagement erleichtert.
4. Südkorea: Proaktive Änderungen in der „Leitfaden zu Freigabetests für Zelltherapieprodukte“
Das südkoreanische Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit (Ministry of Food and Drug Safety, MFDS) hat vor kurzem seine „Leitfaden zu Freigabetests für Zelltherapieprodukte“ aktualisiert. Diese Aktualisierung wurde in Anerkennung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Fluoreszenz-Zellkernfärbemethode vorgenommen. Infolgedessen sind automatisierte Zellzähler, die diese Methode verwenden, nun offiziell als gültiges Testverfahren anerkannt.
In der jüngsten Überarbeitung des Leitfadens werden die Grenzen der Trypanblau-Färbemethode anerkannt und die parallele Verwendung des automatisierten Zellzählers mit Fluoreszenzkernfärbemethode offiziell begrüßt. Diese Entwicklung ist ein positiver Schritt nach vorn, da sie Bedenken im Zusammenhang mit dem Zulassungsverfahren ausräumt und die Tür zu einer genaueren Zellzählung mit fluoreszenzbasierten Zellzählern öffnet.
Mit der Änderung der Verordnung können die automatisierten Fluoreszenz-Zellzähler von NanoEntek (siehe Abbildung „LS-Produktpalette von NanoEntek“), einschließlich des Einkanal-Fluoreszenz-Zellzählers ADAM™ MC2/CellT, des Dual-Fluoreszenz-Zellzählers ADAM™ MC Plus/CellT Plus, des Dreikanal-Fluoreszenz-Zellanalysators ADAMII™ LS/CDx und des automatisierten Hochdurchsatz-Dual-Fluoreszenz-Zellzählers EVE™ HT FL, können nun nahtlos in die Entwicklung, Herstellung, Produktion und klinische Prüfung von Zelltherapieprodukten integriert werden. Diese Anerkennung fluoreszenzbasierter Methoden der Zellzählung als gültiges Testverfahren gewährleistet, dass genaue und zuverlässige Daten gewonnen werden können, die zur Gesamtqualität und Sicherheit von Zelltherapieprodukten beitragen.
5. Fortschrittliche Zellzähler von NanoEntek: Ideales Werkzeug für die Entwicklung und Herstellung von Zelltherapien
Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die Zellkern-Fluoreszenzfärbung durch ihre hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit bei der Herstellung und Qualitätskontrolle von Zelltherapieprodukten aus. NanoEnteks Sortiment an automatisierten fluoreszierenden Zellzählern, einschließlich des ADAM™ MC2/CellT, ADAM™ MC Plus/CellT Plus und ADAMII™ LS/CDx, ist so konzipiert, dass es präzise und zuverlässige Ergebnisse sowohl für die Gesamtzahl der Zellen als auch für ihre Viabilität liefert.
Die ADAM II-Serie ist in der Lage, Zellen anhand von Zelloberflächenmarkern (CD-Marker) genau zu identifizieren und absolut zu zählen. Außerdem kann das EVE™ HT FL, ein Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Zellzähler, bis zu 48 Proben in nur 3 Minuten verarbeiten. Diese außergewöhnliche Präzision und Geschwindigkeit machen das EVE™ HT FL ideal für ein breites Spektrum von Anwendungen, einschließlich der Analyse von Zelllinien und Primärzellen.
(Bild)
Insgesamt sind die ADAM™-Serie, die ADAMII™-Serie und die EVE™ HT FL sehr gut für die Entwicklung zellbasierter Therapien geeignet. Sie bieten eine unvergleichliche Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz, was sie zu unverzichtbaren Werkzeugen für Forschungs-, Entwicklungs- und Produktionsprozesse im Bereich der Zelltherapie macht.
1. Cai Y, Prochazkova M, Kim YS, Jiang C, Ma J, Moses L, Martin K, Pham V, Zhang N, Highfill SL, Somerville RP, Stroncek DF, Jin P. Assessment and comparison of viability assays for cellular products. Cytotherapy. 2024 Feb;26(2):201-209. doi: 10.1016/j.jcyt.2023.11.008. Epub 2023 Dec 11. PMID: 38085197; PMCID: PMC10872314.
2. Council of Europe. Nucleated cell count and viability (2.7.29). European Pharmacopoeia, 10th, 2019: 297-9.
3. Mascotti K, McCullough J, Burger SR. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000 Jun;40(6):693-6. doi: 10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x. PMID: 10864990.
4. Chan LL, Rice WL, Qiu J. Observation and quantification of the morphological effect of trypan blue rupturing dead or dying cells. PLoS One. 2020 Jan 24;15(1):e0227950. doi: 10.1371/journal.pone.0227950. PMID: 31978129; PMCID: PMC6980413.
5. Kim JS, Nam MH, An SS, Lim CS, Hur DS, Chung C, Chang JK. Comparison of the automated fluorescence microscopic viability test with the conventional and flow cytometry methods. J Clin Lab Anal. 2011;25(2):90-4. doi: 10.1002/jcla.20438. PMID: 21437999; PMCID: PMC6647696.