Der Artikel erörtert die Herausforderungen bei der Behandlung von Blutkrebsarten wie Lymphomen, Leukämie und Myelomen und hebt die vielversprechenden Fortschritte bei der CAR-T-Zell-Therapie hervor. Bei der CAR-T-Zell-Therapie werden die T-Zellen eines Patienten so verändert, dass sie gegen Krebszellen gerichtet sind, was eine genaue Zählung der Zellen voraussetzt. Herkömmliche Methoden der Zellzählung mit Trypanblau-Farbstoff sind arbeitsintensiv und fehleranfällig. NanoEntek, ein Unternehmen in Seoul, hat automatisierte Zellzähler entwickelt, die Mikrofluidik und fluoreszenzbasierte Methoden nutzen, die eine größere Genauigkeit und Effizienz bieten.
Fluoreszierende Farbstoffe wie Acridinorange (AO) und DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) helfen bei der Unterscheidung zwischen verschiedenen Zelltypen und verbessern die Genauigkeit beim Zählen kleiner Zellen und Proben mit Verunreinigungen. Diese Methoden sind besonders vorteilhaft für Zell- und Gentherapien, da sie selbst bei komplexen Proben genaue Messungen der Zelllebensfähigkeit gewährleisten.
Die Technologie von NanoEntek, zu der auch Hochdurchsatz-Zellzähler gehören, erhöht die Effizienz der Arbeitsabläufe und erfordert kleinere Probenmengen. Dies ist von entscheidender Bedeutung für die CAR-T-Zell-Therapie, bei der die Stichprobengröße begrenzt ist. Das Unternehmen beabsichtigt, diese Technologien weiterzuentwickeln, um die Immunphänotypisierung einzubeziehen, die für die Unterscheidung verschiedener Immunzellen, die in Zelltherapien verwendet werden, unerlässlich ist. Dieser Fortschritt verspricht, die Präzision und Wirksamkeit von Behandlungen für Blutkrebs und andere therapeutische Bereiche zu verbessern.
Automatisierte Zählung
Ein Unternehmen namens NanoEntek in Seoul, Südkorea, machte sich Anfang der 2000er Jahre auf den Weg, um eine Lösung für dieses Problem zu finden. Begeistert von den Möglichkeiten der Mikrofluidik – einer Technologie, bei der kleine Geräte mit Mikrokanälen zur Analyse von Flüssigkeiten eingesetzt werden – untersuchten die Forscher des Unternehmens deren Potenzial zur Verbesserung der Zellzählung bei Blutproben.
Bei der herkömmlichen Methode wird der Farbstoff Trypanblau verwendet, der nur tote Zellen anfärbt. Ein Pathologe bestimmt die Viabilität der Zellen, indem er die Gesamtzahl der Zellen manuell zählt und dann die Anzahl der gefärbten toten Zellen abzieht (siehe „Zwei Färbemechanismen für die Zellzählung in der Zelltherapie“).
Diese Methode ist jedoch arbeitsintensiv und unterliegt der Variabilität der Bediener. NanoEntek hat den Bedarf an besseren Lösungen erkannt und einen Weg entwickelt, die Zellzählung zu automatisieren. Durch die Einführung automatisierter Zellzähler hat das Unternehmen den Prozess einheitlicher, genauer und benutzerfreundlicher gestaltet. Darüber hinaus haben sie durch den Einbau eines automatisierten Hochdurchsatz-Zellzählers ihre Effizienz erheblich gesteigert.
Zellunterscheidung
Die mangelnde Zuverlässigkeit herkömmlicher Methoden wird mit dem Vormarsch von Zelltherapien, bei denen ein breiteres Spektrum von Zelltypen verwendet wird, einschließlich primärer Zellen, mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und Stammzellen, immer deutlicher.
Eine wesentliche Einschränkung von Trypanblau ist zum Beispiel die Unfähigkeit, zwischen roten Blutkörperchen und PBMC zu unterscheiden. Dies ist besonders kritisch bei der Untersuchung von Erythrozytenprodukten zur Transfusion, da das Vorhandensein von weißen Blutkörperchen eine Immunreaktion beim Empfänger auslösen könnte.
Fluoreszenzfarbstoffe wie Acridinorange (AO) und 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) überwinden diese Einschränkung, indem sie Zellkerne selektiv anfärben. So können Forscher und Kliniker leicht zwischen weißen Blutkörperchen, die einen Zellkern besitzen, und roten Blutkörperchen, denen dieser fehlt, unterscheiden.
Außerdem stellt die geringe Größe der Blutzellen eine zusätzliche Herausforderung für die manuelle Zählung dar. Fluoreszenzfarbstoffe können dieses Problem lösen, da sie Zellkerne selektiv anfärben und unter dem Mikroskop eine starke Fluoreszenz ausstrahlen. Sie ermöglichen somit eine präzisere Messung selbst kleinster Zellen, wie z. B. PBMC, T-Zellen und natürliche Killerzellen, die für die Zelltherapie entscheidend sind.
Darüber hinaus kann das Multi-Frame-Bildgebungsverfahren von NanoEntek die Messgenauigkeit weiter verbessern. „Mit einem automatisierten Bildgebungssystem können mehrere Bilder pro Probe aufgenommen werden“, erklärt Chan Park von NanoEntek. „Da alle Messungen gemittelt werden, wird die resultierende Genauigkeit erheblich verbessert.“
Lösung von Komplikationen
Fluoreszenzbasierte Methoden sind von unschätzbarem Wert, wenn es um Proben geht, die Verunreinigungen enthalten, oder um Proben von Patienten, die beispielsweise unter schweren Entzündungen leiden.
Eine genaue Zellzählung ist für die Zell- und Gentherapie von entscheidender Bedeutung, sagt Beom Choi von InnoBation Bio, einem Unternehmen mit Sitz in Seoul, das den Fluoreszenz-Zellzähler von NanoEntek verwendet. „Die genaue Anzahl der lebenden Lymphozyten, einer Art weißer Blutkörperchen, ist ein einfaches, aber wichtiges Kriterium für die Qualitätskontrolle des Ausgangsmaterials“, erklärt er. „Alles kann schief gehen, wenn diese anfängliche Aussaatdichte falsch gemessen wird.“
Eine Herausforderung bei den konventionellen Techniken ergibt sich, wenn das Immunsystem aktiviert wurde, was zu einer Entzündung führt. Dies kann dazu führen, dass Lymphozytenproben mit einer beträchtlichen Anzahl roter Blutkörperchen verunreinigt sind, die bei herkömmlichen Methoden fälschlicherweise als Lymphozyten gezählt werden. „Da rote Blutkörperchen jedoch keine Kerne haben, nehmen sie den Fluoreszenzfarbstoff nicht auf“, erklärt Choi. „Dadurch können wir die Anzahl der lebenden Zellen im Ausgangsmaterial genau bestimmen.“
Das Einfrieren, eine gängige Praxis in Pathologielabors, stellt eine weitere Herausforderung für herkömmliche Zellzählmethoden dar, da Trypanblau bekanntlich die Zahl der toten Zellen nach dem Auftauen unterschätzt.
Moonsoo Jin, Professor für biomedizinische Technik am Houston Methodist Research Institute in Texas, USA, testet derzeit eines der NanoEntek-Geräte für die Immunphänotypisierung. Er ist begeistert von der Fähigkeit fluoreszenzbasierter Methoden, die Präzision zu verbessern, insbesondere bei Zelltherapieprodukten, die mehreren Gefrier-Tau-Zyklen ausgesetzt sind.
„Die automatisierte, fluoreszenzbasierte Zellzählung erfüllt die Anforderungen an eine genaue und schnelle Zellzählung und Viabilität von Zelltherapieprodukten, die in der Regel während der Herstellung und Produktfreigabe mehrfach eingefroren und aufgetaut werden müssen“, so Jin. „Die Geräte von NanoEntek benötigen nur kleine Probenmengen und liefern genaue und schnelle Ergebnisse zu Zellzahl und Viabilität.“
Diese Kombination aus Genauigkeit, Effizienz und geringem Probenvolumen unterstreicht die bedeutenden Vorteile der fluoreszenzbasierten Zellzählungstechnologie für die Zelltherapie.
Blick auf die Zukunft
In Erweiterung dieser fluoreszenzbasierten Technologie zielt NanoEntek nicht nur auf die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen ab, sondern auch auf die Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten von Immunzellen. Dieser Fortschritt ist von besonderer Bedeutung für die CAR-T-Zell-Therapie zur Behandlung von Blutkrebs, bei der sowohl T-Zellen als auch natürliche Killerzellen eingesetzt werden. Wie Park anmerkt, besteht das Ziel darin, die Möglichkeiten von Zellzählgeräten auf die Immunphänotypisierung auszuweiten, um den sich entwickelnden Anforderungen zellbasierter Therapien gerecht zu werden.
Aufbauend auf diesen Innovationen hat NanoEntek einen automatisierten Hochdurchsatz-Zellzähler entwickelt, der bis zu 48 Proben gleichzeitig verarbeiten kann. Außerdem werden im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wesentlich weniger Proben benötigt. Dies ist besonders vorteilhaft für Szenarien wie die CAR-T-Zell-Therapie, bei der nur ein kleines Volumen für verschiedene Auswertungen zur Verfügung steht.
„NanoEntek hat die Geschwindigkeit und Genauigkeit eines automatisierten Systems mit der Spezifität und Selektivität von Fluoreszenzfarbstoffen in einer einzigen Tischlösung kombiniert“, sagt Park. Dies verspricht eine Verbesserung der Zellanalyse und ebnet den Weg für eine größere Präzision in der biomedizinischen Forschung und Therapie, meint Park.
„Da sich die Zell- und Gentherapie weiter ausbreitet und über Blutkrebs hinaus auch auf solide Tumore ausgedehnt wird, ist die Anwendung von Fluoreszenz-basierten Zellkern-Färbemethoden auf dem besten Weg, sich weiter zu entwickeln, was eine verbesserte Nützlichkeit und Wirksamkeit in einem breiteren Spektrum von therapeutischen Kontexten verspricht“, fügt er hinzu.
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